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尊龙凯时固定免疫沉淀实验方案

发布时间:2025-02-13   信息来源:尊龙凯时官方编辑

免疫沉淀实验是一种在生物医学领域广泛应用的技术,主要用于研究蛋白质相互作用以及蛋白质表达状态。根据实验的要求,研究人员可选择不同的免疫沉淀方法,典型的包括磁珠免疫沉淀法与固定免疫沉淀法。

尊龙凯时固定免疫沉淀实验方案

磁珠免疫沉淀法利用蛋白A或蛋白G磁珠与特定抗体结合,从而有效捕获目标蛋白。这种方法具有操作简单、快速及分离效率高的特点,特别适合于高通量筛选与自动化实验。借助磁性分离架,磁珠能被迅速分离,这使得实验步骤更加简洁。此外,该方法在研究蛋白质-蛋白质相互作用及信号传导途径时尤其有效。

相比之下,固定免疫沉淀法采用固定化的抗体(通常是偶联到珠子上的抗体)以捕获目标蛋白,通常用于蛋白质印迹法(Western Blot)分析前的样品准备。虽然该方法需要较长时间以形成免疫复合物,但能够提供高特异性和灵敏度的结果,适合定量分析目标蛋白的表达和修饰状态。固定免疫沉淀法在研究蛋白质表达水平、翻译后修饰或蛋白质稳定性方面具有重要意义。

下面将详细介绍固定免疫沉淀法的实验流程所需的溶液与试剂:

  • PBS缓冲液
  • 1×细胞裂解缓冲液:20mM Tris(pH 7.5)、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、1% Triton X-100、25mM 焦磷酸钠、1mM β-甘油磷酸酯、1mM Na3VO4、1µg/ml 亮抑酶肽
  • 3×SDS样品缓冲液:187.5mM Tris-HCl(pH 6.8,25°C)、6% w/v SDS、30% 甘油、150mM DTT、0.03% w/v 溴酚蓝

注:以上溶液均应使用超纯水制备。细胞裂解液在使用前需添加1mM PMSF。

1. 制备细胞裂解物

  1. 吸干培养基。根据实验目的,添加新鲜培养基以调节细胞状态,处理一段时间后去除培养基。
  2. 使用冰冷的PBS洗涤细胞一次。
  3. 去除PBS后,每块细胞培养板(10 cm)添加0.5 ml预冷的1×细胞裂解缓冲液和1mM PMSF。
  4. 在冰上孵育5分钟。
  5. 轻轻刮下细胞,转移至微量离心管,保持冰冷。
  6. 在冰上对样品进行四次超声处理,每次5秒。
  7. 在4°C下微量离心10分钟,并将上清液转移至新试管中。
  8. 如果暂时不进行后续实验,应将裂解物保存在-80°C。

2. 免疫沉淀法

  1. 取200μl细胞裂解物,添加10µl固定抗体,放置于摇床上轻摇,在4°C下孵育过夜。
  2. 在4°C条件下微量离心30秒。
  3. 用500µl的1×细胞裂解缓冲液重悬沉淀物进行清洗,离心去除上清,共清洗五次,洗涤期间保持样品于冰上。
  4. 使用20μl 3×SDS样品缓冲液重悬沉淀物,涡旋混匀后再微量离心30秒。
  5. 加热样品至95-100°C,并维持2-5分钟。
  6. 取15-30µl样品上样到SDS-PAGE凝胶,进行蛋白质印迹实验(请参阅蛋白质免疫印迹法实验步骤)。

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