免疫沉淀实验是一种在生物医学领域广泛应用的技术，主要用于研究蛋白质相互作用以及蛋白质表达状态。根据实验的要求，研究人员可选择不同的免疫沉淀方法，典型的包括磁珠免疫沉淀法与固定免疫沉淀法。

磁珠免疫沉淀法利用蛋白A或蛋白G磁珠与特定抗体结合，从而有效捕获目标蛋白。这种方法具有操作简单、快速及分离效率高的特点，特别适合于高通量筛选与自动化实验。借助磁性分离架，磁珠能被迅速分离，这使得实验步骤更加简洁。此外，该方法在研究蛋白质-蛋白质相互作用及信号传导途径时尤其有效。

相比之下，固定免疫沉淀法采用固定化的抗体（通常是偶联到珠子上的抗体）以捕获目标蛋白，通常用于蛋白质印迹法（Western Blot）分析前的样品准备。虽然该方法需要较长时间以形成免疫复合物，但能够提供高特异性和灵敏度的结果，适合定量分析目标蛋白的表达和修饰状态。固定免疫沉淀法在研究蛋白质表达水平、翻译后修饰或蛋白质稳定性方面具有重要意义。

下面将详细介绍固定免疫沉淀法的实验流程所需的溶液与试剂：

• PBS缓冲液
• 1×细胞裂解缓冲液：20mM Tris（pH 7.5）、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、1% Triton X-100、25mM 焦磷酸钠、1mM β-甘油磷酸酯、1mM Na3VO4、1µg/ml 亮抑酶肽
• 3×SDS样品缓冲液：187.5mM Tris-HCl（pH 6.8，25°C）、6% w/v SDS、30% 甘油、150mM DTT、0.03% w/v 溴酚蓝

注：以上溶液均应使用超纯水制备。细胞裂解液在使用前需添加1mM PMSF。

1. 制备细胞裂解物

1. 吸干培养基。根据实验目的，添加新鲜培养基以调节细胞状态，处理一段时间后去除培养基。
2. 使用冰冷的PBS洗涤细胞一次。
3. 去除PBS后，每块细胞培养板（10 cm）添加0.5 ml预冷的1×细胞裂解缓冲液和1mM PMSF。
4. 在冰上孵育5分钟。
5. 轻轻刮下细胞，转移至微量离心管，保持冰冷。
6. 在冰上对样品进行四次超声处理，每次5秒。
7. 在4°C下微量离心10分钟，并将上清液转移至新试管中。
8. 如果暂时不进行后续实验，应将裂解物保存在-80°C。

2. 免疫沉淀法

1. 取200μl细胞裂解物，添加10µl固定抗体，放置于摇床上轻摇，在4°C下孵育过夜。
2. 在4°C条件下微量离心30秒。
3. 用500µl的1×细胞裂解缓冲液重悬沉淀物进行清洗，离心去除上清，共清洗五次，洗涤期间保持样品于冰上。
4. 使用20μl 3×SDS样品缓冲液重悬沉淀物，涡旋混匀后再微量离心30秒。
5. 加热样品至95-100°C，并维持2-5分钟。
6. 取15-30µl样品上样到SDS-PAGE凝胶，进行蛋白质印迹实验（请参阅蛋白质免疫印迹法实验步骤）。

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