关键词:肝微粒体,药物-药物相互作用(DDI),细胞色素P450酶(CYP450),时间依赖性抑制(TDI)
药物-药物相互作用(DDI)是临床中导致严重不良反应乃至死亡的重要原因之一,因此对DDI的可能性、严重性及其影响进行科学评估显得尤为必要。细胞色素P450酶(CYP450)是体内重要的药物代谢酶,其在评估药物相互作用时,主要通过代谢表型研究、酶诱导作用评估及酶抑制作用评估来进行分析。其中,药物对CYP450酶的抑制可分为可逆性抑制和时间依赖性抑制(TDI)。相较于可逆性抑制,TDI带来更为严重的用药安全隐患,因而逐渐受到监管机构及药物研发者的重视。
CYP酶介导的时间依赖性抑制简介
CYP酶介导的酶抑制是指某些化合物抑制部分CYP450代谢酶的活性,导致联合用药时出现代谢减慢、清除率降低及药物暴露量增加等现象,从而引发安全隐患。根据抑制机制的不同,抑制作用分为可逆性抑制和时间依赖性抑制。时间依赖性抑制通常是指候选药物的代谢产物通过共价键与酶结合,导致其不可逆性失活,抑制效应在去除抑制剂后并不会立即消失,而是表现出时间依赖特征。TDI的发生不仅对患者健康构成威胁,也对制药企业提出了挑战,因此逐年受到重视。
相关指导原则《药物相互作用研究技术指导原则(试行)》以及国际会议(ICH)《M12:药物相互作用》均明确要求对在研药物对七种常规CYP同工酶的可逆性与时间依赖性抑制进行体外评估。
时间依赖性抑制体外试验评估
目前,通常采用人肝微粒体进行时间依赖性抑制评估,其常用的方法包括Single-point法、IC50位移法(IC50 shift)和Kinact/Ki法。其中,IC50位移法是较为普遍采用的评估方法,适用于高通量筛选和早期评估。
Single-point法
试验设计:使用单一或两个试验浓度(通常为1μM/10μM),结合一个探针底物浓度,并进行±NADPH预孵育。适用于粗略评估。
评价参数:相对剩余活性计算。若相对剩余活性<80%,提示存在潜在的TDI风险。
IC50位移法
试验设计:设置系列试验浓度,结合一个探针底物浓度,并于±NADPH预孵育30分钟后测定IC50值。
评价参数:IC50位移=IC50(-NADPH)/IC50(+NADPH)。若IC50位移≥15,提示在研药物存在TDI。
Kinact/Ki法
试验设计:多重试验浓度与探针底物浓度,并对±NADPH进行多时间点的预孵育。
评价参数:Kinact/Ki并结合临床PK数据计算R2值评价临床相关性。
IPHASE的时间依赖性抑制试验数据分析
IPHASE作为体外研究生物试剂的领导者,运用IC50位移法验证不同抑制剂对人肝微粒体CYP3A4的时间依赖性抑制作用。通过已知底物睾酮的转化,利用液相-串联质谱(LC-MS/MS)检测6β-羟基睾酮的生成量进一步用于计算IC50值。
抑制剂分析
1. 无TDI作用的抑制剂:例如,NADPH(+)组的IC50为691μM,NADPH(-)组IC50为876μM,IC50位移倍数<15,表明无TDI作用。
2. NADPH依赖的TDI:如在发现NADPH(+)组的IC50曲线显著左移,IC50位移倍数>15,表明存在NADPH依赖的TDI作用。
其他案例分析中,观察不同的抑制剂展现出不同的依赖性与代谢特征,通过评估可以得到更全面的药物安全数据。
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