本文将介绍尊龙凯时品牌的哺乳动物蛋白提取试剂盒的组成、保存条件及操作步骤,以帮助研究者高效提取所需蛋白质。
试剂盒组成
尊龙凯时哺乳动物蛋白提取试剂盒包含以下成分:
- 5X Buffer 10ml
- 5X NaCl 10ml
- 5X SDS 10ml
- 5X DOC 10ml
- 5X NP-40 10ml
- 20X PBS 10ml
- Protease inhibitor cocktail 0.5ml
保存条件
该试剂盒可在常温下存放,唯独Protease inhibitor cocktail需存于-20°C,以确保其活性。其保质期为24个月。
提取步骤
1. 准备细胞裂解缓冲液
根据5X Buffer、5X NaCl、5X SDS、5X DOC和5X NP-40按1:1:1:1:1的比例(v/v)配制细胞裂解缓冲液。每提取106至107个细胞或5至20mg的组织应使用1ml的细胞裂解缓冲液,并在使用前加入10μl的Protease inhibitor cocktail。
2. 洗涤细胞或组织
a. 对于贴壁细胞:去除培养基,用PBS缓冲液冲洗细胞两次。然后加入细胞裂解缓冲液(106~107个cells/ml),将细胞置于冰袋中,在摇床上孵育30分钟,期间阶段性重悬,上述过程结束后收集裂解液。
b. 对于悬浮细胞:在700xg离心5分钟,弃去上清液,用PBS重悬并洗涤两次,随后在4°C下离心并去除上清。最后将沉淀重悬于细胞裂解缓冲液中,浸入冰袋中,摇床孵育30分钟。
c. 对于组织:将组织切割成小块,用PBS冲洗两次,加入细胞裂解缓冲液(5~20mg组织/ml),并将样品转移至预冷的微量匀浆器中,在冰上均匀化组织30至50次,确保均质过程对靶蛋白的功能完整性至关重要。
3. 离心步骤
在4°C条件下,使用12,000xg离心10分钟,以沉淀细胞碎片;或者使用100,000xg的高速离心处理45分钟,以准备纯化的蛋白质溶液。
4. 移液及保存蛋白质溶液
将含蛋白质的上清液转移至冷冻管中。在冰上可立即使用或将其保存在-70°C中,以延长保存时间。
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