蛋白质糖基化是一种重要的翻译后修饰(PTM),它在多种生物功能中发挥着关键作用。糖基化的异常与炎症及肿瘤等疾病密切相关,因此,糖基化成为寻找疾病相关生物标志物的重要研究方向。糖基化过程展现出宏观和微观的异质性,分别体现在不同糖基化位点和不同糖型及结构的多样性。这使得完整的糖肽分析在揭示蛋白层面的糖基化信息上,展现出比切糖分析更大的优势,这也是糖蛋白组学的一项重大挑战。
通过质谱方法对糖肽进行全面表征,已被证明是实现位点特异性糖蛋白组学分析和生物标志物筛选的有效工具。近期,复旦大学的乔亮教授团队与SCIEX团队、百蓁生物的单宝珍博士合作,在《Analytical Chemistry》上发布了题为“Quantitative Site-Specific Glycoproteomics Reveals Glyco-Signatures for Breast Cancer Diagnosis”的研究文章。该研究通过优化质谱分析方法和机器学习算法,从乳腺癌临床样本中鉴定并定量了位点特异性的糖基化特征,最终发现了15种潜在的糖基标记物,可用于乳腺癌的检测。
研究方法
该研究分析了124份临床血清样本,涵盖40名乳腺恶性肿瘤(MT)患者、43名良性病变(BL)患者及41名健康对照(Con)。研究人员通过优化ZenoTOF 7600质谱仪的动态碰撞能量设置,收集糖肽数据,利用GlycanFinder 20软件对其进行鉴定与定量,并应用主成分分析(PCA)和随机森林算法筛选位点特异性的糖基化标志物。最终通过靶向MS/MS验证了这些标志物在不同组间的表达差异,为乳腺癌的诊断提供了新的潜在标记物。
研究结果
完整N-糖肽检测流程建立
研究团队首先建立了一个完整的糖肽鉴定质谱数据采集和分析流程,探索糖肽鉴定的信息学解决方案。经过对比动态与固定的碰撞能量(CE)条件,发现动态CE在糖肽鉴定数量及位点特异性糖基鉴定中表现更佳。此外,GlycanFinder 20在不同CE条件下提供了最为稳定的糖肽鉴定数量和得分。
乳腺癌血清糖蛋白组分析
利用上述流程,研究人员对124名女性参与者的血清样本进行了分析,结果显示在糖蛋白质组层面,共鉴定出6901个独特的位点特异性糖链,涉及807个糖基化位点,其中以唾液酸化糖基化修饰为主。
乳腺癌糖蛋白组与蛋白质组的差异分析
研究发现,乳腺恶性肿瘤、良性肿瘤和对照组的糖蛋白组在定量分析中呈现显著差异,而蛋白质组的差异较小。差异表达的位点特异性糖链主要与凝血、糖胺聚糖结合、肽酶活性及免疫反应等生物功能相关。KEGG通路分析显示,补体和凝血级联反应在乳腺癌患者中显著改变,而胆固醇代谢则在乳腺癌与良性肿瘤中下调。
乳腺癌诊断N-糖生物标记的发现
为了筛选潜在的生物标志物,研究者利用随机森林构建了样本分类器。通过从位点特异性糖链中筛选出的15个潜在糖基标记物,建立了乳腺癌检测的分类模型。该模型在训练集上实现了0.98的AUC值,而在验证集上达到了0.99,表明具有较高的诊断准确性。针对这15个候选糖基标志物的靶向质谱分析进一步验证了它们在乳腺癌诊断中的潜力。
结论
本研究提出了一种使用质谱技术进行完整糖肽表征的方法,展示了其在临床血清样本中进行大规模位点特异性定量糖蛋白组分析的应用潜力。研究结果表明,位点特异性糖蛋白组为疾病生物标志物的研究提供了新的机会,并在基础和临床糖蛋白组学研究中展现出广阔的应用前景。
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