细胞冻存是一种在低温环境下保存细胞的有效方法，旨在长期维持细胞的活性与功能。这种技术在细胞系的长期保存、实验重复性、基因库构建以及细胞治疗的储备中起着至关重要的角色。通过冻存，可以显著减少细胞在传代中可能出现的遗传变异，避免因污染、环境变化或实验操作失误而导致的细胞损失。最佳的冷冻保存时机是细胞处于最佳增殖状态时。

在细胞冻存过程中，冷冻保护剂是关键因素，常用的包括二甲基亚砜（DMSO）和甘油。这些保护剂的主要作用是降低溶液的冰点，减少冰晶生成，从而保护细胞免受冰晶的机械性损伤。虽然DMSO适用于大多数细胞类型，但某些细胞对其敏感，届时可用甘油作为替代。

第一阶段：冷冻保存实验步骤

1. 在冷冻管上标记日期、研究者姓名、细胞编号、传代数以及细胞类型（例如，是否进行了基因改造等附加信息）。

2. 对于贴壁细胞，需先去除培养基，用PBS清洗，再加入适量的胰蛋白酶覆盖细胞，在37°C的培养箱中孵育约2分钟（具体时间根据培养的细胞类型调整）。接着，加入等量培养基终止消化，用移液枪轻柔吹打细胞，冲洗下贴壁细胞，转移至50mL Falcon管中。

3. 对于悬浮细胞，直接将所需体积的细胞移至50mL Falcon管中。

4. 使用血细胞计数器计数细胞以确定活力，冷冻保存时细胞活力应不低于75%。

5. 在室温下以300×g离心5分钟。

6. 准备冻存培养基（详见表1）。

表1 不同哺乳动物细胞系适用的冻存培养基配方：

• 在含FBS培养基中培养的细胞：90%胎牛血清 + 10%二甲基亚砜
• 在无血清培养基中培养的细胞：90%条件培养基 + 10%二甲基亚砜
• 需要甘油冷冻的细胞：90%胎牛血清 + 10%甘油

在使用前，须将其混合均匀并加热至37°C。冷冻培养基应含有必需的冷冻保护剂（如DMSO），以防止细胞内外形成可能损伤细胞屏障的冰晶。同时需注意，并非所有细胞类型都适合DMSO，有些情况下可用甘油替代。

7. 去除上清液。

8. 加入冻存培养基至所需细胞密度，通常哺乳动物细胞的浓度为1×10⁶/mL，而在冻存液中停留的时间不应超过10分钟。

9. 将1mL样品分装至冷冻管中并盖紧。

10. 将冷冻管转移至室温冷冻盒，再放入-80°C冰箱中，冷冻盒外周加入适量异丙醇，以确保温度以每分钟1°C的速度缓慢下降。由于冷冻前会有水分流出，因此缓慢的冷冻过程有助于减少细胞内冰晶的形成。

11. 约24小时后，将冷冻管取出并转移至液氮中进行长期储存。一般情况下，冷冻细胞可以在液氮中保存数年。理想状态下，应避免在-80°C下长期保存（不超过一周），并迅速转移至液氮，以免损害细胞活性。

第二阶段：解冻冷冻细胞系实验步骤

1. 从液氮存储器中取出冷冻管，迅速放入37°C水浴中，直到大约80%解冻（切勿室温下解冻），此过程不应超过1分钟。缓慢解冻的过程可能会对细胞造成伤害，因此需尽快完成解冻。

2. 使用移液器将冷冻管中的内容物转移至约10mL预热培养基的15mL Falcon管中。

3. 以300×g离心5分钟，弃去上清液，用适量培养基重悬细胞沉淀。

4. 将细胞悬液转移到培养容器中，并放入37°C培养箱中继续培养。

细胞冻存与解冻过程对保障细胞活性和实验成功至关重要。选择合适的冷冻保护剂和优化操作步骤能够提高细胞存活率。充分了解细胞冻存技术，尤其是[尊龙凯时]等生物医疗品牌的相关研究与应用，有助于在生物医药领域取得更好成果。